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ELISA試劑盒對試劑預備一般不太注意，一般的做法是，在試驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而疏忽了這種做法有也許影響后邊溫育時刻不行的疑問，其直接的結果是對一些弱陽性標本的檢查呈現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的預備zui為要害的是，在試驗開端前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在運用前與室溫平衡。這么做的意圖，主要是為了在后邊的溫育反響步驟中，能使反響微孔內的溫度能較快地到達所請求的高度，以滿意測定請求。其次，如今的產品ELISA試劑盒中的洗板液均需在試驗室運用時對所提供的濃縮液稀釋制造，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應確保質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反響顯色前暫時制造。

在如今的ELISA試劑盒產品試劑盒中，血清樣本的參加幾乎是*的要運用微量加樣器參加樣本的步驟。運用微量加樣器加樣有必要注意的要害點是：加樣不行太快，要避免加在孔壁上部，不行濺起和發生氣泡。加樣太快，無法確保微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易致使非特異吸附。濺起會對附近孔發生污染。呈現氣泡則反響液界面有區別。試劑的參加在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很主要，滴加太快，很簡單呈現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這么就會在孔內的非包被區呈現非特異吸附，然后導致非特異顯色。所以，有時候一份標本用一樣的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，通常即是上述加樣及試劑的過錯所造成的。

溫育是ELISA試劑盒測定中影響測定勝敗zui為要害的一個要素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的反響在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*，有必要在必定的溫度條件下反響必定的時刻。溫育所需時刻與溫度成反比，即溫度越高，則所需時刻相對較短。zui為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。